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知識講解:細胞培養的步驟和注意事項
更新時間:2023-08-15瀏覽:1543次

  知識講解:細胞培養的步驟和注意事項

  1:細胞復蘇

  低溫保存的細胞從液氮中取出后,在37℃的水浴中不斷搖晃,以促進其融化。將解凍后的細胞移入離心管,加入37℃(胎牛血清約10%)預熱的DMEM培養基中,輕輕吹掃離心,500克離心2分鐘,丟棄上清液。

  加入DMEM清洗,并丟棄上清液。加入DMEM全培養基,輕輕吹勻,制成細胞懸液,接種于皿/瓶中,在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

  2:細胞通道

  當細胞密度達到80%~90%(早產不足,細胞條件不好,1:2~1:10或以上比例傳代,一般1:3~1:5細胞發生,即從細胞接種到分離再培養的一段時間內,非細胞有絲分裂的次數),取出完整培養基,洗滌兩次1x PBS。

  加入胰蛋白酶(注:消化液覆蓋細胞的最佳量,最佳消化溫度為37℃。顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞。如果細胞質收縮,細胞不再連接成碎片,說明此時細胞的消化是合適的),并將其放入細胞培養箱中約2-3分鐘。

  加入適量DMEM全培養基停止胰蛋白酶消化,移入離心管離心2分鐘,棄去上清液,然后加入DMEM全培養基洗滌,棄去上清液。

  加入DMEM全培養基,輕輕吹勻,取10μL計數,按要求的細胞體積在含5%CO2的細胞培養箱中繼續培養。

  3:細胞冷凍保存

  當細胞密度達到80%~90%時,去除全培養基,用1x PBS洗滌兩次。加入胰蛋白酶消化,放入細胞培養箱約2-3分鐘。加入DMEM全培養基停止胰蛋白酶消化,移入離心管,離心500g,離心2min,棄去上清液,然后加入DMEM全培養基洗滌,棄去上清液。加入LML凍存液(90%胎牛血清,10%二甲基亞砜)。一般來說,血清含量可以在10%到90%之間調節。一方面在凍存液中加入血清可以為細胞提供營養,另一方面可以提供蔗糖、白蛋白等不滲透的保護物質,在凍存過程中更好地保護細胞。放入低溫保存管(管內加入異丙醇,以保證降溫速度),立即放入4℃冰箱內冷凍30分鐘,然后放入-20℃冰箱30分鐘,再放入-80℃冰箱過夜。

  第二天放入液氮中,至少可以保存兩年。如果沒有,可以保存三個月。

  細胞冷凍復蘇的原理是:緩慢冷凍和快速解凍,這樣更有利于保持細胞的活力。不加任何保護劑的細胞低溫保存會導致細胞內產生冰晶,引起細胞內的機械損傷、滲透壓、pH值和電解質的變化,進而導致細胞死亡。

  4:注意事項

  (1) 預熱培養液:將配制好的含培養液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴中預熱;

  (2) 用75%酒精擦拭超凈工作臺和紫外線照射的手;

  (3) 正確放置使用過的設備:保證足夠的操作空間,既方便操作又減少污染;

  (4) 酒精燈:注意火焰不要太小;

  (5) 嚴格無菌操作;

  (6) 貼壁細胞的消化是中等的:消化時間受多種因素的影響,如消化液的種類、制備時間和加入培養瓶中的量。在消化過程中,應注意培養細胞形態的變化。一旦細胞質收縮,連接變松,或有碎片漂浮的跡象,消化應立即終止;

  (7) 傳代細胞的所有操作應盡可能靠近酒精燈火焰。最好一次只操作一個電池,每個電池使用一套設備。避免交叉感染;

  (8) 每次打開或關閉細胞瓶口時,都需要在酒精燈上消毒

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