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標簽： 實時 熒光定量PCR realtime PCR 本生生物
所謂實時熒光定量 PCR 技術，是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
原理及材料：
實驗材料：細胞樣品
試劑、試劑盒：RNA 提取試劑盒 熒光定量 PCR MixTRIZOL dNTP lf 仿 逆轉錄酶 MMLV ybc Taq 酶 DEPC 水 ddH2O TE MgCl2 瓊脂糖 溴化乙錠 MOPS jiaquan 乙酸鈉 EDTA EB 溴酚蘭
儀器、耗材：離心管 離心機 風光光度計 電泳槽 凝膠板 Realtime PCR 儀
實驗步驟:
一、 樣品 RNA 的抽提
1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置 5 分鐘使其溶解。
2. 兩相分離 每 1 ml 的 TRIZOL 試劑裂解的樣品中加入 0.2 ml 的 lf，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體 15 秒后，15 到 30℃孵育 2 到 3 分鐘。4℃下 12 000 rpm 離心 15 分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚 lf 相，中間層以及無色水相上層。RNA 全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的 TRIZOL 試劑的 60%。
3. RNA 沉淀 將水相上層轉移到一干凈無 RNA 酶的離心管中。加等體積 ybc 混合以沉淀其中的 RNA，混勻后 15 到 30℃孵育 10 分鐘后，于 4℃下 12 000 rpm 離心 10 分鐘。此時離心前不可見的 RNA 沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
4. RNA 清洗 移去上清液，每 1 mlTRIZOL 試劑裂解的樣品中加入至少 1 ml 的 75% 乙醇（75% 乙醇用 DEPCH2O 配制），清洗 RNA 沉淀?；靹蚝螅?℃下 7 000 rpm 離心 5 分鐘。
5. RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室溫空氣中干燥 5-10 分鐘。
6. 溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 時，先加入無 RNA 酶的水 40μl 用槍反復吹打幾次，使其溶解，獲得的 RNA 溶液保存于 - 80℃待用。
二、 RNA 質量檢測
1. 紫外吸收法測定
先用稀釋用的 TE 溶液將分光光度計調零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計 260nm 和 280nm 處的吸收值，測定 RNA 溶液 濃度和純度。
（1）濃度測定
A260 下讀值為 1 表示 40 μg RNA/ml。樣品 RNA 濃度 (μg/ml) 計算公式為：A260 × 稀釋倍數 × 40 μg/ml。具體計算如下：
RNA 溶于 40 μl DEPC 水中，取 5 μl，1:100 稀釋至 495 μl 的 TE 中，測得 A260 = 0.21
RNA 濃度 = 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取 5 ul 用來測量以后，剩余樣品 RNA 為 35 μl，剩余 RNA 總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
（2）純度檢測
RNA 溶液的 A260/A280 的比值即為 RNA 純度，比值范圍 1.8 到 2.1。
2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測定
（1）制膠
1 g 瓊脂糖溶于 72 ml 水中，冷卻至 60℃，10 ml 的 10× MOPS 電泳緩沖液和 18 ml 的 37% jq 溶液 (12.3 M)。
10×MOPS 電泳緩沖液
濃度 成分
0.4 M MOPS，pH 7.0
0.1 M 乙酸鈉
0.01 M EDTA
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入 25 μl 溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的 1×MOPS 電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
（2）準備 RNA 樣品
取 3 μgRNA，加 3 倍體積的 jq 上樣染液，加 EB 于 jq 上樣染液中至終濃度為 10 μg/ml。加熱至 70℃孵育 15 分鐘使樣品變性。
（3）電泳
上樣前凝膠須預電泳 5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm 電壓下 2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少 2-3 cm。
（4）紫外透射光下觀察并拍照
28S 和 18S 核糖體 RNA 的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提 RNA 的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的 2 倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的 RNA（tRNA 和 5S 核糖體 RNA）組成。在 18S 和 28S 核糖體帶之間可以看到一片彌散的 EB 染色物質，可能是由 mRNA 和其它異型 RNA 組成。RNA 制備過程中如果出現 DNA 污染，將會在 28S 核糖體 RNA 帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA 的降解表現為核糖體 RNA 帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。
三、樣品 cDNA 合成
1. 反應體系
序號 反應物 劑量
1 逆轉錄 buffer 2 μl
2 上游引物 0.2 μl
3 下游引物 0.2 μl
4 dNTP 0.1 μl
5 逆轉錄酶 MMLV 0.5 μl
6 DEPC 水 5 μl
7 RNA 模版 2 μl
8 總體積 10 μl
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm 短暫離心。
2. 混合液在加入逆轉錄酶 MMLV 之前先 70℃干浴 3 分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶 0.5 μl，37℃水浴 60 分鐘。
3. 取出后立即 95℃干浴 3 分鐘，得到逆轉錄終溶液即為 cDNA 溶液，保存于 - 80℃待用。
四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量 PCR
1. β-actin 陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為 1011，反應前取 3 μl 按 10 倍稀釋（加水 27 μl 并充分混勻）為 1010，依次稀釋至 109、108、107、106、105、104，以備用。
2. 反應體系如下：
標準品反應體系
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 陽性模板上游引物 F 0.5 μl
3 陽性模板下游引物 R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq 酶 1 μl
6 陽性模板 DNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 總體積 50 μl
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm 短暫離心。
3. 管家基因反應體系：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 內參照上游引物 F 0.5 μl
3 內參照下游引物 R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq 酶 1 μl
6 待測樣品 cDNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 總體積 50 μl
輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm 短暫離心。
3. 制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃ 2 分鐘，然后 93℃ 1 分鐘，55℃ 2 分鐘，共 40 個循環。
五、 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的 DNA 模板
1. 針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的 cDNA 模板進行 PCR 反應。
2. 反應體系
序號 反應物 劑量
1 10× PCR 緩沖液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物 F 0.5 ul
4 下游引物 R 0.5 ul
5 dNTP 混合液 3 ul
6 Taq 聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至總體積為 25 ul
輕彈管底將溶液混合，6000rpm 短暫離心。
35 個 PCR 循環（94℃1 分鐘；55℃1 分鐘；72℃1 分鐘）； 72?C 延伸 5 分鐘。
（3）PCR 產物與 DNA Ladder 在 2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測 PCR 產物是否為單一特異性擴增條帶。
（4）將 PCR 產物進行 10 倍梯度稀釋：將 PCR 產物進行 10 倍梯度稀釋：設定 PCR 產物濃度為 1×1010，依次稀釋至 109、108、107、106、105、104 幾個濃度梯度。
六、 待測樣品的待測基因實時定量 PCR
1. 所有 cDNA 樣品分別配置實時定量 PCR 反應體系。
2. 體系配置如下：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
4 dNTP 1 ul
5 Taq 聚合酶 2 ul
6 待測樣品 cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm 短暫離心。
（3）將配制好的 PCR 反應溶液置于 Realtime PCR 儀上進行 PCR 擴增反應。反應條件為：93℃ 2 分鐘預變性，然后按 93℃ 1 分鐘，55℃1 分鐘，72℃1 分鐘，共 40 做個循環，最后 72℃7 分鐘延伸。
七、 實時定量 PCR 使用引物列表
引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不在模板的非目的位點引發 DNA 聚合反應 (即錯配)。
八、電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進行 Realtime PCR 反應。PCR 產物與 DNA Ladder 在 2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView 染色，檢測 PCR 產物是否為單一特異性擴增條帶。
注：僅供參考！
