聯系電話：
18502669006
服務熱線： 15502280048
服務熱線： 
標簽：熒光定量 PCR PCR 試劑 實時熒光定量 PCR 耗材
所謂實時熒光定量 PCR 技術 ，是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個 PCR 進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。以下便是天津本生生物就熒光定量 PCR 原理的簡要說明，一起來看下：
檢測方法：
1.SYBRGreenⅠ法：在 PCR 反應體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產物的增加*同步。SYBR 定量 PCR 擴增熒光曲線圖 PCR 產物熔解曲線圖 (單一峰圖表明 PCR 擴增產物的單一性)
2.TaqMan 探針法：探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR 擴增時，Taq 酶的 5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物的形成*同步。
1. 熒光閾值 (threshold) 的設定 PCR 反應的前 15 個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省 (默認) 設置是 3-15 個循環的熒光信號的標準偏差的 10 倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct 值與起始模板的關系每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，公式如下。Ct =-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n 為擴增反應的循環次數，X0 為初始模板量，Ex 為擴增效率，N 為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。起始拷貝數越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代 Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
實時熒光定量 PCR 所使用的熒光物質可分為兩種：
1. TaqMan 熒光探針：PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR 擴增時，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成*同步。而新型 TaqMan-MGB 探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變 (SNP)，有望成為基因診斷和個體化用藥分析的當選技術平臺。
2. SYBR 熒光染料：在 PCR 反應體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料非特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產物的增加*同步。SYBR 僅與雙鏈 DNA 進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定 PCR 反應是否特異。
3. 分子信標：是一種在 5 和 3 末端自身形成一個 8 個堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR 產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定 DNA 序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光 。
1. 傳統定量 PCR 方法簡介：
1) 內參照法：在不同的 PCR 反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在 PCR 產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2) 競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增 (其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化 PCR 產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。3)PCR-ELISA 法：利用 digaoxin 或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗 digaoxin 或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規的 PCR-ELISA 法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
2. 內標在傳統定量中的作用由于傳統定量方法都是終點檢測，即 PCR 到達平臺期后進行檢測，而 PCR 經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在 96 孔 PCR 儀上做 96 次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3. 內標對定量 PCR 的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則 PCR 反應變為雙重 PCR，雙重 PCR 反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。 實時熒光定量 PCR 技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品 Ct 值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。
因此，實時熒光定量 PCR 無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1)Ct 值的重現性 PCR 循環在到達 Ct 值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期 (對數期)，此時微小誤差尚未放大，因此 Ct 值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的 Ct 值是恒定的。
2)Ct 值與起始模板的線性關系由于 Ct 值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量 PCR 是一種采用外標準曲線定量的方法。外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量 PCR 是迄今為止定量準確，重現性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。 各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。由于 qPCR 是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優
產品優勢：
本生生物代理實驗室耗材,PCR 耗材品種全，可替代儀器原廠耗材，性價比高，質量穩定，對用戶可以節省實驗成本。
適應客戶：
醫院檢驗科 PCR 實驗室，中心實驗室，肝病中心；第三方檢測機構，科研院所，大專院校，制藥廠，試劑生產廠家，疾控中心，檢驗檢疫。
注：本信息終歸屬權：本生 (天津) 健康科技有限公司，以上信息僅供參考!
下一篇：詳述PCR封板膜的分類
